Суета вокруг белкового кристалла

В июле этого года арестовали бывшую сотрудницу Национальной ускорительной лаборатории Стэнфордского университета близ города Пало-Альто штата Калифорния (SLAC National Accelerator Laboratory) Сильвию Оммахен (Silvya Oommachen). Ее действия привели к уничтожению четырех тысяч кристаллов, которые были извлечены из контейнеров, где они хранились при специально подобранных условиях. Сильвия Оммахен оставила контейнеры на рабочем столе при комнатной температуре, в результате чего кристаллы растаяли.

Мотивом такого странного преступления, видимо, послужили плохие отношения с руководством: сотрудница считала, что перерабатывает, и требовала дополнительной оплаты своей работы. Одновременно у нее ухудшались отношения с коллегами. Наконец, 17 июня, она была уволена и спустя месяц решилась на месть. 27 июля, благополучно миновав два поста охраны, она прошла к своему бывшему рабочему месту и открыла холодильник… Руководитель проекта Айен Уилсон (Ian A. Wilson) заявил, что эксперименты с большей частью кристаллов были практически закончены и их утрата не представляет большой беды. Но со ста двадцатью образцами работа еще даже не начиналась. На их восстановление потребуется не меньше полумиллиона долларов и от нескольких недель до нескольких месяцев работы.

Понятно, что речь о каких-то очень непростых кристаллах: речь не может идти, например, о бриллиантах. Алмазы, из которых изготавливают бриллианты, это уже готовый кристалл, дело только в том, чтобы их правильно огранить. В цену бриллианта стоимость получения кристалла как такового не входит. Отдельным образом следует платить за образование корунда, но там стоимость кристаллизации получается значительно меньшей. Что же это за таинственные кристаллы? Ответ неожиданно прост: это кристаллы белков. Получение их дорогостоящая и трудоемкая процедура.

Кристаллы на просвет

Разница между алмазом и графитом заключается просто в том, как атомы расположены друг относительно друга. При том что в обоих этих веществах атомы одни и те же — атомы углерода. Свойства же решетки, в вершинах которой они располагаются совсем разные. Эти свойства определяются движениями всей решетки, при которых она как целое остается в неподвижности (обычно считается, что она бесконечна). Атомы просто перемещаются из одних узлов в другие. Никакие новые узлы появляться не должны, а также не должны исчезать имеющиеся. Например, куб можно поворачивать на 90° вокруг оси, проходящей через центры двух противоположных граней, или 120° вокруг любой из его больших диагоналей.

Как выяснилось еще в начале ХХ века, узнать, что представляет собой кристаллическая решетка, можно с помощью рентгеновских лучей. Темным точкам на рентгеновском снимке кристалла соответствуют вовсе не мягкие ткани, как на снимке челюсти человека, а определенные свойства симметрии решетки. Потом из невразумительных точек и кругов с помощью специальных математических преобразований получают информацию о расположении атомов. Для неспециалистов выглядят как шарлатанство. Даже если решетка несложной формы, эта задача непростая, но все честно.

Однако уже во второй половине ХХ века оказалось, что метод применим не только к минералам. Очень большие и сложные биологические молекулы тоже можно исследовать с помощью рентгеновских лучей, если заставить их «уложиться» в кристалл. Именно таким образом удалось определить. что из себя представляет молекула ДНК . Знаменитую «двойную спираль» сконструировали на основе дифракционной картины кристаллов ДНК. Для того чтобы понять строение молекулы белка, из нее тоже надо получить кристалл.

Мелодия кристаллизации

Ученые, работающие в этой области, как композиторы, должны создать свою «мелодию» — методику очистки и кристаллизации данного белка. Эксперты говорят, что кристаллизация каждого белка индивидуальна и условия получения кристаллов невозможно предсказать. Можно только ставить опыты «наугад». Поэтому структурная биология, которая базируется на анализе кристаллов, несмотря на множество современных методов, призванных обеспечить положительный результат научной работе, до сих пор остается лотереей. Нередко на то, чтобы узнать структуру одного белка, уходят годы.

Что касается этапа очистки, в последнее время он стал довольно рутинным, хоть и остается трудоемким и требующим индивидуального подбора условий. Общая стратегия такова. В культуру клеток, например, кишечной палочки, вводят много копий того гена, который кодирует интересующий исследователя белок, и выращивают бактерии , создавая идеальные условия для их роста — оптимальную температуру и необходимое питание. Чтобы наработать достаточное количество исследуемого белка (десяток миллиграммов), иногда выращивают сотни граммов бактерий, то есть 10¹⁴ штук.

Ген кодирует не только сам изучаемый белок, но и специальную белковую «метку», поэтому с гена считывается меченый белок. Затем отделяют нужный белок от всех прочих, используя вещество, связывающееся с этой меткой — нужный белок остается «привязанным» к очистителю, все остальные белки проходят сквозь него. Потом следует еще несколько этапов очистки, чтобы в конечном счете получился раствор одного-единственного белка без примесей. Это необходимое условие для дальнейшей кристаллизации.

Дальше начинается этап проб и ошибок, бесконечных повторов и разочарований, одним словом, кристаллизации.

Хорошо, что помощники есть — скрининговые машины. Скрининг — процесс методичного перебора сотен различных условий, в данном случае для получения кристаллов белка. Белок может кристаллизоваться при строго определенных условиях: 1) определенной кислотности раствора; 2) определенной температуре; 3) в присутствии некоторого вещества-осадителя определенной концентрации. Кислотность раствора и соль-осадитель заранее неизвестны, поэтому в скрининговые машины заправляются матрицы с сосудами, в которые залиты растворы с рН, меняющимся с выбранным шагом, и различными солями тестируемых концентраций.

Лучшие светила структурной биологии пессимистично разводят руками в ответ на вопрос, можно ли заранее предсказать, в каком растворе и при каком рН образуются кристаллы. Пока неизвестны какие-либо закономерности этого процесса, остается только методично-добросовестный скрининг. При большом везении при переборе 600 условий кристаллизации найдется 1–2 раствора, в которых появятся кристаллы. Как правило, на первом этапе они небольшие, непрозрачные и совершенно неправильной формы, то есть не подходящие для рентгеноструктурного анализа.

Но и это большой успех — найдены приблизительные условия кристаллизации, дальнейшая задача — улучшить их.

Для этого экспериментатор, как опытный грибник, начинает ходить «вокруг да около» первоначального «гриба», или, как ученые сами говорят, «играться с изначальными условиями кристаллизации». Тут уже скрининговые машины не помощники, надо продолжать подбор условий вручную.

Иногда и «ручной труд» не приносит результатов — кристаллы или вовсе не образовываются, или же такие плохонькие, что не дают дифракционной картинки.

Нервничающий экспериментатор предпринимает отчаянные попытки. Например, можно отправлять белок… в космос.

Космические опыты

Два последних десятилетия космическая технология, в частности биотехнология, бурно развиваются. Когда-то среди американских школьников проводили конкурс — надо было придумать космический эксперимент. Один ребенок предложил посмотреть, как в условиях невесомости паук будет плести паутину (есть польза от «Человека-паука»). Обычно паук спускает первую нить вертикально вниз, например, прыгая с ветки, но в космосе нет «верха» и «низа», как нет и многих других вещей, привычных на Земле. В космосе по-другому горит свеча, точнее, она вскоре гаснет, если не обеспечить искусственный приток кислорода к ней, потому что это на Земле нагретый воздух поднимается вверх, а на смену ему приходит новый, богатый кислородом, в невесомости же нет подобной циркуляции. В космосе из закипевшего чайника не вырывается струя пара…

Вышеперечисленные примеры могут считаться просто удовлетворением научного любопытства («А что если паука отправить космос? Прикольно будет»). Но космическая технология, как показало время, может быть и очень доходной отраслью изготовления уникальных материалов, дающих новый толчок в развитии науки и технологии. Например, кристаллы полупроводников требуются микроэлектронике для создания уникальных лазеров, тепловизоров, чувствительных датчиков ядерных излучений. Как показали первые эксперименты, в невесомости полупроводниковые кристаллы выращиваются из расплава в более благоприятных условиях, чем на Земле. В расплаве отсутствует обязательная на Земле тепловая конвекция, из-за чего в растущем кристалле нет связанных с ней дефектов.

Биологи также решили испробовать космос для своих нужд: в частности, оказалось, что трудно кристаллизующиеся белки хорошо образуют кристаллы в условиях микрогравитации, причем очень правильной формы, так что они образуют «качественную» дифракционную картину рентгеновских лучей.

В настоящее время в космосе ведутся опыты по получению идеальных кристаллов в условиях микрогравитации, имеющие целью разработку вакцин против ВИЧ , гепатита В , лихорадки Западного Нила и других неизлечимых пока болезней. Также предпринимаются попытки изучить какие-то закономерности роста кристаллов, чтобы эта область перестала наконец быть «терра инкогнита», став предсказуемым, послушным инструментом в руках исследователей.

Подобный бриллианту

Кристаллы могут иметь разнообразную форму — палочковидные, кубические, звездчатые (по-английски их называют «ежистыми»); женщины-экспериментаторы предпочитают кристаллы, похожие на многогранные бриллианты. Если процесс кристаллизации удался, надо срочно получать картину дифракции, потому что внезапно появившийся кристалл может так же внезапно и пропасть. Зато одного-единственного кристалла правильной формы и прозрачности достаточно для определения структуры белка.

Точнее, недостаточно. Нужен еще всего-навсего очень мощный источник рентгеновских лучей. По сравнению с которым рентгеновский аппарат из поликлиники — как петарда по сравнению с ракетой-носителем. Такими источниками являются синхротроны — ускорители заряженных частиц. Несколько таких источников рентгеновских лучей есть в Европе , а самый мощный из них — European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) — находится в Гренобле .

В отличие от более известных ускорителей соседнего CERN под Женевой, которые спрятаны глубоко под землей, ESRF построен на поверхности. Он выглядит как аккуратный «бублик» длиной 844 м, который хорошо виден со спутников и превосходит здание Пентагона в номинации «самая удобная мишень для атаки с воздуха». Внутри бублика — кольцевой «коридор», по которому в вакууме носятся элементарные частицы, ускоренные электрическим полем до скоростей, близких к скорости света. Двигаясь по кругу, частицы излучают, в частности, рентгеновские лучи, которые как раз и нужны биологам. В отличие от элементарных частиц, сотрудники не могут так легко перемещаться вдоль шестикилометрового кольца ускорителя, поэтому они ездят по «офису» на велосипедах.

Белок и его портрет

Человеческий организм нуждается ежедневно в сорока граммах белка, что примерно равно двумстам граммам куринного филе, двумстам пятидесяти граммам творога или трёмстам пятидесяти граммам гречневой крупы (среди круп она самая богатая белком).

Недостаток белков в питании вызывает у детей замедление роста и развития, а у взрослых — глубокие изменения в печени, нарушение деятельности желез внутренней секреции, изменение гормонального фона, ухудшение усвоения питательных веществ, проблемы с сердечной мышцей, ухудшение памяти и работоспособности.

Съеденный белок в организме расщепляется на составляющие — аминокислоты, которые затем используются для строительства собственных белков организма. Белков около пяти миллионов. Почти все функции, обеспечивающие нашу жизнедеятельность, выполняются белками — «молекулярными машинами». Белки служат «мишенями» для подавляющего большинства ядов и современных лекарств. Чтобы понять, как работает машина, надо иметь чертеж. Именно такую роль играет его «рентгеновский портрет».

В Гренобль «на флюорографию» свои драгоценные белковые кристаллы привозят ученые со всей Европы. Драгоценные — без преувеличений. На получение одного кристалла белка ученые могут потратить десятки тысяч евро, а фармацевтические компании готовы заплатить еще большие деньги за подробную информацию о структуре какого-нибудь важного для медицины белка — «замка», к которому можно подбирать «отмычку» — лекарство.

Гонять элементарные частицы — дорогое удовольствие, поэтому синхротрон используется круглосуточно, тем более что все желающие с девяти до восемнадцати часов ни за что бы не успели. На зависть ученым во многих других институтах, на территорию ESRF можно приехать в любой день недели (и любую ночь) без специальных разрешений. Те, кто уезжает ночью, часто видят на газонах вокруг синхротрона непуганых кроликов и говорят: «Ну вот, доработался до кроликов». И с людьми тоже порой случается всякое. Как в случае Оммахен.

Ее неожиданное преступление вызвало бурную дискуссию среди ученых о требованиях безопасности в научных учреждениях. Чрезмерное ужесточение правил мешает нормальной работе. И без того бесчисленные формальности занимают изрядную долю рабочего времени — сортировка мусора (как минимум пять ведер), специальная процедура уничтожения биологических отходов, тренинги по безопасности, особенно при работе с опасными вирусами , или раковыми клетками , специальные пропускные карточки и коды на дверях в помещения, переодевания. Однако произошедший случай показал, как легко один человек может причинить огромный ущерб важному научному проекту.

В анонсе статьи использовано фото HASYLAB/DESY, Max Planck working groups, Hamburg